在高效液相色譜（HPLC）分析工作中，色譜峰的形態(tài)直接決定了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。不少實(shí)驗(yàn)室從業(yè)者都曾遇到過(guò)倒峰、拖尾峰等異常峰形問(wèn)題，不僅影響檢測(cè)效率，還可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)誤判，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)諸多困擾。本文就針對(duì)這些常見(jiàn)的峰形問(wèn)題，深入剖析其產(chǎn)生原因，并分享實(shí)用的解決方法，幫你輕松應(yīng)對(duì)HPLC峰形難題。

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一、倒峰（Negative Peak）

倒峰是指出峰方向與正常峰相反（向下）的峰。很多人遇到這種情況會(huì)誤以為是儀器故障，其實(shí)其產(chǎn)生多與檢測(cè)器響應(yīng)、溶劑差異、系統(tǒng)污染等因素相關(guān)，具體主要原因及解決方法如下：

1. 檢測(cè)器背景差異（常見(jiàn)原因）

原因：當(dāng)樣品溶液中某成分的吸光度（或響應(yīng)值）低于流動(dòng)相背景時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)倒峰。例如，使用UV檢測(cè)器時(shí)，樣品在檢測(cè)波長(zhǎng)下“更透明”。典型場(chǎng)景包括溶劑差異和流動(dòng)相不一致，前者是指樣品溶劑的紫外吸收強(qiáng)度低于流動(dòng)相，比如用純水或低吸收溶劑溶解樣品，而流動(dòng)相含有較高紫外吸收的組分（如乙腈、甲醇、緩沖鹽在低波長(zhǎng)下）；后者則是樣品制備使用的溶劑與流動(dòng)相的pH、離子強(qiáng)度或有機(jī)相比例不一致。

解決方法：盡量使用流動(dòng)相或接近流動(dòng)相的溶劑溶解樣品；確保進(jìn)樣體積不要過(guò)大（通常<25μL）；在方法開(kāi)發(fā)時(shí)，注意選擇對(duì)樣品和流動(dòng)相都合適的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2. 折射率變化（RI效應(yīng)）

原因：紫外檢測(cè)器對(duì)折射率變化敏感。當(dāng)樣品組分流過(guò)流通池時(shí)，引起局部折射率突變，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)短暫的負(fù)信號(hào)或正負(fù)雙峰。這在低波長(zhǎng)（<220 nm）下尤其明顯。

解決方法：升高檢測(cè)波長(zhǎng)（如升至254 nm以上）；優(yōu)化樣品溶劑，使其折射率與流動(dòng)相匹配；降低樣品濃度或進(jìn)樣量。

3. 色譜柱污染或柱流失

原因：色譜柱上強(qiáng)保留的污染物在分析過(guò)程中被洗脫，或者固定相發(fā)生流失，這些物質(zhì)可能在檢測(cè)器上產(chǎn)生反向響應(yīng)，形成倒峰。

解決方法：徹底沖洗和再生色譜柱；使用保護(hù)柱或在線過(guò)濾器；確保流動(dòng)相pH在色譜柱耐受范圍內(nèi)，避免固定相過(guò)度流失。

二、拖尾峰（Tailing Peak）

拖尾峰通常用拖尾因子（Tf, USP）或不對(duì)稱因子（As）衡量，理想值接近1.0，Tf > 1.2 通常認(rèn)為拖尾。拖尾峰的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致峰面積積分不準(zhǔn)確、分離度下降，影響多個(gè)組分的同時(shí)檢測(cè)，其主要產(chǎn)生原因及解決方法如下：

1. 色譜柱“死”吸附或活性位點(diǎn)（硅醇基效應(yīng)）

這是堿性化合物拖尾的常見(jiàn)原因。色譜柱固定相殘留的硅醇基（-Si-OH）與帶正電的分析物發(fā)生次級(jí)相互作用，導(dǎo)致分析物在柱內(nèi)保留時(shí)間延長(zhǎng)，形成拖尾。

解決方法：調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，對(duì)于堿性化合物，降低pH（如pH 2-3）使其質(zhì)子化，減少與硅醇基的離子交換；使用緩沖鹽，加入適當(dāng)?shù)木彌_鹽（如磷酸鹽、甲酸鹽）競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn)；降低流動(dòng)相極性，增加有機(jī)相比例；使用三乙胺等掃尾劑，競(jìng)爭(zhēng)硅醇基位點(diǎn)（但需注意對(duì)柱子的長(zhǎng)期影響和質(zhì)譜兼容性）；更換色譜柱，選擇封端更好的C18柱，或?qū)ｉT用于堿性化合物的高純硅膠柱、AQ系列柱、雜化顆粒柱（如HSS）等。

2. 柱外效應(yīng)

原因：進(jìn)樣器、連接管路或檢測(cè)器流通池的死體積過(guò)大，導(dǎo)致譜帶展寬和拖尾。死體積過(guò)大會(huì)使分析物在系統(tǒng)內(nèi)停留時(shí)間不一致，部分組分提前流出，部分組分延遲流出，終形成拖尾峰。

解決方法：使用內(nèi)徑更小、長(zhǎng)度更短的連接管線（如0.12mm或0.17mm內(nèi)徑）；確保所有接頭擰緊無(wú)死體積，避免分析物在接頭處滯留；選擇合適的流通池，常規(guī)分析勿用半制備池，減少流通池內(nèi)的體積干擾。

3. 色譜柱裝填問(wèn)題或柱床塌陷

原因：色譜柱性能下降，塔板數(shù)降低。色譜柱裝填不均勻、使用過(guò)程中柱床塌陷，會(huì)導(dǎo)致分析物在柱內(nèi)流動(dòng)路徑不一致，部分組分通過(guò)速度快，部分組分通過(guò)速度慢，進(jìn)而形成拖尾峰。

解決方法：若柱床塌陷不嚴(yán)重，可嘗試反向沖洗色譜柱；若沖洗后無(wú)改善，或柱效下降嚴(yán)重，則需更換新色譜柱。日常使用中避免劇烈壓力波動(dòng)，延長(zhǎng)色譜柱使用壽命。

4. 化學(xué)/二次相互作用

原因：分析物與流動(dòng)相或固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)（如絡(luò)合）；或系統(tǒng)存在金屬雜質(zhì)污染（特別是對(duì)磷酸鹽、羧酸鹽、螯合劑等分析物），這些相互作用會(huì)導(dǎo)致分析物保留異常，形成拖尾峰。

解決方法：使用高純?cè)噭┖汀暗徒饘匐s質(zhì)”色譜柱，減少金屬雜質(zhì)干擾；在流動(dòng)相中加入螯合劑（如EDTA，注意pH和溶解性），絡(luò)合系統(tǒng)中的金屬雜質(zhì)；優(yōu)化流動(dòng)相組成，避免分析物與流動(dòng)相、固定相發(fā)生不良化學(xué)反應(yīng)。

三、其他常見(jiàn)問(wèn)題峰及原因

在HPLC分析中，除了倒峰和拖尾峰，還可能遇到前延峰、雙峰/分叉峰、鬼峰/未知峰、峰展寬、保留時(shí)間漂移等異常問(wèn)題，其具體原因和解決方法如下表所示：

四、通用排查流程建議

當(dāng)HPLC分析中出現(xiàn)峰形異常問(wèn)題時(shí)，盲目調(diào)整參數(shù)往往事倍功半，遵循以下系統(tǒng)性排查步驟，能更高效地定位根本原因：

1. 重現(xiàn)問(wèn)題：首先確認(rèn)問(wèn)題是否穩(wěn)定重現(xiàn)，排除偶然因素（如單次進(jìn)樣污染）的影響。

2. 簡(jiǎn)化系統(tǒng)：通過(guò)空白實(shí)驗(yàn)隔離問(wèn)題來(lái)源。不進(jìn)樣，運(yùn)行空白梯度，判斷是系統(tǒng)/流動(dòng)相問(wèn)題還是樣品問(wèn)題；注入純?nèi)軇ㄈ缂状迹?，判斷是否為溶劑效?yīng)；注入標(biāo)準(zhǔn)品，判斷是方法問(wèn)題還是樣品問(wèn)題。

3. 隔離變量：每次只改變一個(gè)變量，并記錄結(jié)果，避免多個(gè)變量干擾導(dǎo)致無(wú)法定位原因?？筛鼡Q另一根已知性能良好的同型號(hào)色譜柱，判斷是否為柱問(wèn)題；使用新鮮配制的流動(dòng)相和樣品，判斷是否為污染/降解；更換檢測(cè)波長(zhǎng)，判斷是否為檢測(cè)器相關(guān)問(wèn)題。

4. 系統(tǒng)檢查：全面檢查泵、檢測(cè)器、柱溫箱、管路和接頭是否正常，排除儀器硬件故障導(dǎo)致的峰形異常。

高效液相色譜儀峰形問(wèn)題的產(chǎn)生，多與儀器狀態(tài)、色譜柱選擇、流動(dòng)相優(yōu)化和樣品處理等因素相關(guān)。記住“每次只改變一個(gè)變量”的排查原則，結(jié)合上述原因和解決方法，就能逐步定位并解決問(wèn)題。

希望這份詳細(xì)的總結(jié)能幫助你系統(tǒng)性地解決HPLC分析中遇到的各種峰形問(wèn)題，保障分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性！如果在實(shí)際操作中遇到復(fù)雜的峰形問(wèn)題，也可咨詢專業(yè)的儀器售后技術(shù)人員獲取針對(duì)性解決方案。

常見(jiàn)問(wèn)題（FAQ）

問(wèn)1：HPLC分析中，目標(biāo)峰出現(xiàn)后緊接著出現(xiàn)一個(gè)小肩峰，是什么原因?qū)е碌?？該如何解決？

答：目標(biāo)峰后出現(xiàn)小肩峰，核心原因多為兩種：一是目標(biāo)組分與樣品中微量雜質(zhì)未完全分離，屬于共流出干擾；二是色譜柱柱效下降，固定相局部塌陷或污染，導(dǎo)致組分分離能力下降。解決方法：首先優(yōu)化分離條件，可適當(dāng)降低流動(dòng)相流速、調(diào)整梯度洗脫程序（如減緩有機(jī)相比例提升速度）或升高柱溫，增強(qiáng)分離效果；若優(yōu)化條件后無(wú)改善，需對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗再生，更換保護(hù)柱；若再生無(wú)效，說(shuō)明色譜柱已損壞，需更換新柱。同時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步凈化處理，去除微量雜質(zhì)干擾。

問(wèn)2：同一批樣品連續(xù)進(jìn)樣，峰高忽高忽低，峰形無(wú)明顯異常，這是什么問(wèn)題？

答：這種情況主要與進(jìn)樣系統(tǒng)不穩(wěn)定或樣品均一性差相關(guān)。具體原因包括：進(jìn)樣針堵塞或泄漏，導(dǎo)致實(shí)際進(jìn)樣量不一致；進(jìn)樣閥密封墊磨損，出現(xiàn)漏液現(xiàn)象；樣品溶液未充分混勻，部分樣品濃度存在差異；流動(dòng)相流速波動(dòng)，影響峰高響應(yīng)。解決方法：先檢查進(jìn)樣針，用有機(jī)溶劑沖洗疏通，更換損壞的進(jìn)樣針；檢查進(jìn)樣閥密封墊，若有磨損及時(shí)更換，確保進(jìn)樣閥無(wú)漏液；進(jìn)樣前將樣品溶液充分搖勻，必要時(shí)進(jìn)行超聲處理，保證樣品均一；校準(zhǔn)泵的流速，確保流動(dòng)相流速穩(wěn)定，同時(shí)檢查流動(dòng)相瓶?jī)?nèi)溶劑是否充足，避免因溶劑不足導(dǎo)致流速波動(dòng)。

問(wèn)3：使用梯度洗脫時(shí)，基線漂移嚴(yán)重且伴隨雜峰，影響目標(biāo)峰判斷，該怎么處理？

答：梯度洗脫時(shí)基線漂移嚴(yán)重并伴隨雜峰，主要原因是流動(dòng)相純度不足、梯度洗脫程序設(shè)置不合理或系統(tǒng)污染。流動(dòng)相中若含有微量雜質(zhì)，在梯度變化過(guò)程中，雜質(zhì)的響應(yīng)值會(huì)隨流動(dòng)相比例變化而波動(dòng)，導(dǎo)致基線漂移和雜峰；梯度程序中有機(jī)相比例變化過(guò)快，會(huì)引起檢測(cè)器響應(yīng)突變，產(chǎn)生基線波動(dòng)；系統(tǒng)內(nèi)殘留的污染物在梯度洗脫過(guò)程中被洗脫，形成雜峰。解決方法：使用色譜純?cè)噭┡渲屏鲃?dòng)相，配制后充分過(guò)濾脫氣；優(yōu)化梯度洗脫程序，減緩有機(jī)相比例的變化速率，在梯度開(kāi)始前增加平衡時(shí)間（一般10-20分鐘），讓系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；梯度洗脫結(jié)束后，用高比例有機(jī)相沖洗系統(tǒng)和色譜柱，去除殘留污染物，避免污染累積。

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